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BCF UMR INRA 1163 / AFMB UMR CNRS 7257 Marseille
- Stagiaire Master 2
2014 - 2014Objectif du stage : élucider la fonction du module DUF1996 (nommé X123 dans la base de données CAZy) largement retrouvé chez les champignons et bactéries. Trois modules X123 de Podospora anserina avec des modularités différentes ont été sélectionnées. Les génes correspondant ont été exprimés en expression hétérologue chez la levure Pichia pastoris. L'étude se porte sur un criblage fonctionnel d'activité sur une large gamme de substrats glycosidiques. Des tests de cristallogenèse ont aussi été réalisés pour résoudre la structure tridimensionnelle de ce module par radiocristallographie aux rayons X.
Analyse bio-informatique de X123
Production de protéines recombinantes :
-cultures de levure P. pastoris transformées et induction
-purification sur chromatographie d'affinité sur colonne de Nickel
-purification sur colonne de gel perméation
-quantification de la concentration des protéines purifiées
-estimation de la pureté des protéines par SDS-PAGE
Tests d'activité enzymatique :
-observation des produits de réaction par chromatographie ionique (HPAEC-PAD)
sur substrats complexes issus de la paroi végétale
-détermination des paramètres optimaux de pH et température
-détermination des activités spécifiques sur le substrat préférentiel
-cinétiques d'hydrolyse d'oligosaccharides et détermination de l'efficacité catalytique
Tests de cristallogenèse
UFIP UMR CNRS 6286, Université de Nantes
- Stagiaire Master 1
2013 - 2013Objectif du stage : réaliser des mutants de l'alpha-galactosidase TmaGal capables de réaliser des réactions de transglycosylation par approche semi-rationnellle (application des mutations efficaces sur une enzyme de famille proche).
Synthèse des mutants :
-choix des mutants par observation de la superposition de structure 3D des sites actifs des enzymes AgaB et TmaGal
-mutagenèse dirigée par PCR "Quickchange"
-transformation sur cellules compétentes BL21 (DE3)
-vérification des mutants par séquençage puis mise en culture des mutants pour production de protéines.
Production de protéines :
-culture puis induction des protéines, lyse des cellules
-purifications des protéines par chromatographie d'affinité sur colonne de Nickel-NTA
-dosage au Nanodrop
-observation sur gel SDS-PAGE.
Observation de l'activité enzymatique :
-observation des produits de réaction sur plaque CCM
UFIP UMR CNRS 6286, Université de Nantes
- Stagiaire Licence 3
2012 - 2012Objectif du stage : ingénierie de l'arabinofuranosidase (Araf 51) pour obtenir des mutants capables de réaliser de la transglycosylation.
Mutation du gène codant pour l'enzyme Araf 51 : mutation saturante par mégaprimer. PCR, purification de plasmides, quantification de l'ADN au Nanodrop, électrophorèse sur gel d'agarose, digestions enzymatiques.
Culture de bactéries XL1 E.coli, préparation de boîtes de Pétri, transformation de cellules.
Préparation d'extraits enzymatiques à partir des cultures des mutants obtenus. Observation des produits de réaction de transglycosylation sur plaque CCM.
